從熒光的發(fā)光原理開始，簡單介紹免疫熒光（IF）應(yīng)用

　　熒光分子可以說是生物學(xué)研究中最經(jīng)常使用的標(biāo)記分子，它們作為探針標(biāo)記目標(biāo)分子，可用于監(jiān)測其表達(dá)量及示蹤。它們相對于放射性同位素更加安全和環(huán)保，相對于不發(fā)光的標(biāo)記物如HRP或金屬顆粒等更加靈敏。因而應(yīng)用非常廣泛。下面我們將從熒光的發(fā)光原理開始，簡單介紹免疫熒光（IF）應(yīng)用。

光相關(guān)知識點(diǎn)

　　光是一種可見的電磁波，是能量的輻射形式。光的波長越長，光子的能量越小。

　　光進(jìn)入某物質(zhì)后，部分或全部的光能可被物質(zhì)的分子或原子所吸收。光的吸收具有選擇性，一定能量的光量子輻射只能被一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)吸收。

熒光物質(zhì)知識點(diǎn)

　　熒光的基礎(chǔ)知識：熒光是物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。

　　熒光物質(zhì)的種類：芳香族及雜環(huán)化合物、熒光蛋白、納米顆粒（量子點(diǎn)）。

　　熒光物質(zhì)發(fā)光原理：光照射到某些原子時(shí)，光的能量使原子核周圍的一些電子由原來的軌道躍遷到了能量更高的軌道，即從基態(tài)躍遷到**激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等。**激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等是不穩(wěn)定的，瞬間將恢復(fù)基態(tài)，當(dāng)電子由**激發(fā)單線態(tài)恢復(fù)到基態(tài)時(shí)，能量會以光的形式釋放，產(chǎn)生熒光。

　　每一種熒光物質(zhì)都有其特定的激發(fā)光譜（Excitation）和發(fā)射光譜（Emission）。通常以相對強(qiáng)度為縱軸，以波長為橫軸，這些吸收光譜和發(fā)射光譜有很好的對應(yīng)關(guān)系。激發(fā)光譜是固定發(fā)射光的波長，測量激發(fā)光的波長（有時(shí)候也測波數(shù)或者頻率等）與熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系；發(fā)射光譜是固定激發(fā)波的波長，測定發(fā)射光強(qiáng)度與波長的關(guān)系。熒光物質(zhì)的發(fā)射波長總是大于其激發(fā)波長。

熒光標(biāo)記的應(yīng)用

　　熒光標(biāo)記幾乎可以用于所有生物學(xué)檢測，作為蛋白或抗體標(biāo)記物可用于ELISA、IF、FCM、WB，蛋白芯片、及活體成像等，作為核酸標(biāo)記物可用于FISH、基因芯片、qRT-PCR等。熒光標(biāo)記幾乎可以用于從宏觀的活體研究到微觀的組織、細(xì)胞、分子，甚至分子內(nèi)、分子間作用的所有生物學(xué)研究領(lǐng)域。

　　熒光標(biāo)記最常見的生物學(xué)應(yīng)用是免疫熒光（IF）和流式細(xì)胞術(shù)（FCM）。在免疫熒光中，最常用的是靶點(diǎn)胞內(nèi)定位、示蹤及活體分子成像等。